膨胀显微成像技术(expansion microscopy,ExM)是一种新型超高分辨成像技术。该技术借助可膨胀水凝胶均匀地放大生物样本,在常规光学宽场条件下轻松实现高分辨成像,在普通共聚焦条件下实现超高分辨成像。蛋白质、核酸、脂质等生物大分子均可借助 ExM 进行超高分辨成像。本产品经过系统优化和验证,适用于细胞爬片免疫荧光实验,可将样本在三维方向均匀地放大 4.5 倍左右,相应的空间分辨率也能提高 4.5 倍左右。由于空间的均匀拉伸,膨胀后,生物分子的空间分布关系不受影响。

还原本真
3D均匀膨胀,不改变生物分子的空间分布前沿科技
利用膨胀显微技术,轻松获得超高分辨图像物美价廉
用普通试剂的成本获得超高分辨的图像细胞爬片、倒置荧光显微镜。
按免疫荧光实验流程操作,获得经荧光染色的细胞爬片,并确保可以观察到荧光信号后,利用本试剂盒完成下述过程。
特别注意:①需将原荧光抗体浓度提高5~10倍使用,原因详见注意事项4;②以下操作步骤以9mm细胞爬片为例,如使用其它规格细胞爬片,可根据情况调整各试剂用量,并使用合适的制胶模具。1. 配胶:将试剂 A、试剂 B 和试剂 C 按照下表比例混合配制成胶溶液,以9mm细胞爬片为例,推荐使用φ10mm孔板制胶模具,一般使用100μL胶溶液即可完全覆盖单孔细胞样本;

注意:
①先将试剂 A、试剂 B 加入EP管,轻柔混匀;随后加入试剂 C ,轻柔混匀;
②若使用 14 mm 爬片,需要用到φ15 mm 孔板制胶模具时,一般配制 240 μL 胶溶液即可完全覆盖单孔细胞样本。
2. 灌胶:准备两张封板膜,将其中一张封板膜 (撕去保护膜) 贴在φ10 mm 孔板制胶模具底部,把细胞爬片 (有细胞的一面朝上) 放入胶孔内,沿孔壁缓慢灌入步骤 1 混匀后的胶溶液 (切勿直冲孔底,避免吹起细胞),并覆盖上另一张封板膜 (撕去保护膜),使胶孔形成封闭空间,此过程需避免产生气泡,最后将灌完胶的模具室温避光孵育 45 min,确保胶完全凝固;
3. 拆胶:小心地移除封板膜,将凝胶从制胶模具中取出,可以看到细胞已附着在凝胶的表面;
注意:凝胶会有些干粘,可以加少量纯净水润湿,以便顺利取下。4. 膨胀:将凝胶样本置于约 100 mL 纯净水中 (需确保容器洁净且宽敞),避光室温膨胀 2 h 后或者 4℃过夜膨胀;
5. 成像:倒掉容器中剩余的水分,小心取出膨胀后的凝胶样本,用纯净水配制 DAPI 染液 (1 μg/mL),复染凝胶样本 2 min,接着用纯净水漂洗 2~3 次 (3~5 min/ 次) 去除多余的 DAPI 染料。小心地取出凝胶样本,裁成合适的尺寸,请将凝胶有细胞的一面朝下 (有爬片凹痕的那一面),置于玻底培养皿中或载玻片上,无需封片,直接选择合适的倒置荧光显微镜进行观察或拍照,其间注意添加少量纯净水,使样本保持湿润。
注意: ①根据物镜镜头使用相匹配的耗材进行成像,比如在油镜下观察或拍照需使用玻底皿,空气镜需使用载玻片;观察或拍照过程中,避免凝胶样本被高强度且长时间激光照射; ②DAPI 在凝胶膨胀过程中会与核酸脱离,因此需要复染 DAPI。注意避光操作,且切勿使用 PBS 配制 DAPI 染液,否则会发生缩胶; ③使用普通宽场显微镜拍摄,采集图像时会遇到同一视野下不同区域清晰度不一的情况,模糊的区域是未对焦造成的。样本经 3D 均匀拉伸后,厚度变大,需要在不同焦距下拍摄多张图片,再对这些图片进行投影融合处理即可,或使用景深扩展功能进行拍摄。备注:若采用 35 mm 外径玻底皿直接培养细胞开展免疫荧光实验,灌胶与拆胶可参照如下操作:
灌胶:向铺有细胞的玻底皿玻璃凹面中,加入步骤 1 配制并混匀的胶溶液 (约 300μL,可根据玻底皿规格酌情调整加样体积),胶液完全覆盖玻璃凹面,待胶液液面与周边塑料皿体齐平后,盖上玻底皿贴膜压平液面。操作全程尽量避免气泡产生。灌胶完成后,将玻底皿置于室温避光条件下孵育 45 min,保证凝胶充分凝固。拆胶:轻轻揭除玻底皿贴膜,用镊子小心地取出凝胶,此时细胞应附着于凝胶表面。后续可直接执行前述膨胀、成像操作。
1. 实验过程中建议使用商品化纯净水 (如娃哈哈纯净水),以免实验用水质量不达标,影响样本膨胀效果;
2. 本产品不适合活细胞成像实验;
3. 本产品针对细胞爬片设计,不可用于组织切片的处理;
4. 由于体积的膨胀,样本的单位荧光强度会降低。在进行免疫荧光实验时,建议将荧光抗体的稀释浓度提高 5~10 倍使用。具体操作如下:
直接提高荧光二抗的使用浓度 ( 建议使用雅酶荧光二抗,货号﹕LF107~LF110)。例如,原本 1:1,000 使用荧光二抗,此时可以提高至 1:100~200。如果提高荧光二抗浓度后结果仍不理想,也可以适当提高一抗浓度。
调整后得到的免疫荧光结果,在最大激发光强度下,目镜观察会感觉非常明亮甚至刺眼,即可进行后续细胞膨胀操作。
5. 为了您的安全和健康 ,请穿实验服并戴一次性手套操作;
6. 本产品仅限科研使用。
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