1. 制备杂交瘤细胞 (具体步骤此处从略)

• 注意：

  ① 杂交瘤细胞融合前至少 1 周复苏传代骨髓瘤细胞 SP2/0，确保无支原体污染，融合当天处于对数生长期；

  ② SP2/0 与 B 淋巴细胞融合后的细胞较为脆弱，须先将融合细胞置于含细胞因子及 HAT 的液体培养基中37℃、5% CO₂培养箱孵育 2~4 h，促进其恢复。

2.半固体克隆和筛选 (以 6 孔板示例)

• 杂交瘤快速筛选半固体培养基使用前须充分混匀。

  用于融合后初次筛选

  根据融合时 SP2/0 细胞用量计算细胞密度，按表一用量将杂交瘤快速筛选半固体培养基和杂交瘤细胞加入 6 孔板的同一个孔中，轻柔混匀，置于 37℃、5% CO₂培养箱中静置培养 5 天。

  
  

  用于亚克隆筛选

  按表二用量将杂交瘤快速筛选半固体培养基和杂交瘤细胞加入 6 孔板的同一个孔中，轻柔混匀，置于 37℃、5% CO₂培养箱中静置培养 5 天。

  
  

  注意：

  ① 若需接种多孔 (共 n 孔)，建议按 n+1 孔计算培养基总量，每孔分装 3 mL 至 6 孔板，最后加入杂交瘤细胞轻柔混匀；

  ② 取放细胞培养板时须动作轻缓，保持水平，避免细胞在半固体培养基中发生位移。

3. 克隆挑取与筛选

• ⑴ 观察细胞团的增殖状态及大致数量；

  ⑵ 准备 96 孔板，每孔加入 200 μL 液体培养基；

  ⑶ 用 10 μL 微量移液器吸取细胞团，转移至 96 孔板中，置于 37℃、5% CO₂培养箱中静置培养 5~10 天

  注意：不同大小的克隆株均需挑选，生长较慢、形态偏小的克隆同样可能具备优异的抗体分泌能力，而在传统多克隆混杂的增殖环境中，这类竞争性弱势克隆极易被优势克隆压制而丢失，造成优质候选株的漏检。

  ⑷ 待细胞覆盖孔底 30% 以上，即可用适当方法 (如 ELISA、流式细胞术或 Western blot) 筛选阳性克隆。