产品简介

本试剂盒可以将蛋白高效共价标记 BF488 荧光染料 (Ex/Em：494/517 nm，与 Alexa Fluor^® 488 光谱等效)。反应性 BF488 荧光染料带有琥珀酰亚胺酯 (NHS ester)，可与蛋白质的伯胺 (R-NH₂) 高效反应，形成稳定的染料 - 蛋白偶联物。

试剂盒所配纯化柱预装即用型树脂，专为高效去除未偶联荧光染料而优化，兼顾出色的蛋白回收性能

产品内容

操作步骤

试剂准备

向反应性 BF488 荧光染料管中加入 15 μL 无水溶剂，涡旋至完全溶解，即得到 10 mM 染料溶液。分装后于-20℃避光保存，两个月内有效；

注意：无水溶剂 4°C 保存时为固态，请置于室温 (25°C) 完全融化后再使用。

向碳酸氢钠管中加入 1 mL 超纯水，涡旋至完全溶解，即得到 1 M 碳酸氢钠溶液 (pH 8.3)。4℃可保存两周，或冷冻长期保存。

蛋白准备

为获得最佳标记效率，纯化蛋白须置于不含铵离子或伯胺的缓冲液中；若蛋白处于含 Tris 或甘氨酸等的缓冲液中，应通过脱盐柱或透析将缓冲液更换为 PBS 或 0.1 M 碳酸氢钠溶液；若使用碳酸氢钠溶液，可省略标记步骤 1 中添加 1/10 体积碳酸氢钠溶液的操作；

用 PBS 或 0.1 M 碳酸氢钠合适缓冲液将蛋白浓度调至 2 mg/mL 以上，低于 2 mg/mL 可能会影响荧光标记效率；

不纯蛋白 (如粗血清中的抗体) 标记效果不佳。

蛋白标记<以50 μg 抗体 (150 kda) 为例>

1. 向 25 μL 的 2 mg/mL 蛋白溶液中加入 2.5 μL 预先配制的 1 M 碳酸氢钠溶液；

2. 按下列公式计算反应性 BF488 荧光染料用量，其中 MR 为染料: 蛋白摩尔比，推荐值为 4~10：

例如：标记 50 μg IgG (分子量 150,000)，MR 取 10，反应性 BF488 荧光染料用量如下：

3. 向蛋白溶液中加入 0.3 μL 预先配制的反应性 BF488 荧光染料，混匀后室温反应 1 h (推荐在翘板摇床上进行)。

蛋白纯化

4. 拧下纯化柱底部密封塞，拧松顶部盖子 (勿取下)；

5. 将纯化柱置于收集管中，离心 (2,000×g，2 min)，弃去流出液，以去除储存缓冲液；

6. 在纯化柱树脂倾斜面较高侧的柱壁做标记﹔后续所有离心步骤中，均保持标记侧朝向离心机转子外侧；

注意：纯化柱方向放置错误可能导致染料去除效果不佳。

7. (可选) 向纯化柱中加入 400~500 μL PBS，离心 (2,000×g，2 min)，弃去流出液；

8. 将预处理后的纯化柱转入新的 1.5 mL 离心管，取下顶部盖子，将 100 μL BF488 标记蛋白样品 (提前用 PBS 补足至 100 μL) 缓慢加至树脂中心；

9. 离心 (2,000×g，2 min)，弃去纯化柱，离心管中收集的液体即为纯化后的蛋白样品。可测定 A₂₈₀ 和 A₄₉₄ 以计算蛋白浓度与标记度 (DOL)。

注意：标记后的蛋白于 4℃避光保存；长期保存建议添加 0.1% BSA 和 2 mM 叠氮钠。

标记度 (DOL) 计算方法

1. 计算蛋白摩尔浓度

注意：0.11 为 BF488 荧光染料对 280 nm 吸光度的校正因子 (CF)

2. 计算染料摩尔浓度

注意：BF488 荧光染料消光系数ε_dye 等于 71,000 M^-1·cm^-1。

3. 计算标记度 (DOL)

例如：用 BF488 标记 IgG，染料和蛋白的稀释倍数均为 1，测得 A₂₈₀=0.6，A₄₉₄=0.7，IgG 消光系数 ε_protein=210,000，计算如下：