产品简介

Omni-ECL^TM基础型化学发光检测试剂盒(皮克级)是一款非放射性的化学发光系统，可用于检测结合到膜上的蛋白所偶联的辣根过氧化物酶(HRP)的活性。本产品包括增强的鲁米诺底物及稳定的过氧化物体系，能检测低至皮克级的微量蛋白，适用于常规Western Blot的化学发光。

产品内容

使用说明

• 1.

  从洗涤缓冲液中取出转印膜，沥去多余的液体，使膜保持湿润状态；

• 2.

  等体积混匀PicoLight ECL Substrate和Oxidant，配制化学发光工作液(每平方厘米的转印膜约需0.1mL的工作液)；

• 3.

  将化学发光工作液均匀滴到膜上，反应1~2min。如要检测的蛋白信号很高，请尽量不要让化学发光工作液处于静止状态，可将加了工作液的膜置于摇床上混动1~2min，以避免局部的反应物过度消耗，影响检测信号的线性范围；

• 4.

  取出膜，沥去多余的发光工作液，将膜包裹于透明的保护夹中；

• 5.

  X光片曝光：在暗室中将膜对X光片曝光。曝光时间从几秒到几分钟不等。将底片显影，如有必要，可根据显影结果调整曝光时间进行第二次曝光；
  CCD成像仪：无需将膜置于保护夹中，可直接用于拍照。拍照按仪器使用说明进行；

• 6.

  使用过的膜可剥离抗体后进行多次杂交。

常见问题及对策

案例一：没有信号或者信号很弱

分析：

1、样本：是否降解；是否靶蛋白丰度低难以检测；是否上样量太低；

解决办法：蛋白提取时低温操作，加蛋白酶抑制剂，蛋白保存注意避免反复冻融，防止蛋白降解；提高样品浓度，增加上样量；

2、转膜：是否转膜效率低；

解决办法：优化转膜条件，如增加转膜时间，提高转膜电压/电流，选择合适孔径膜；

3、显影检测：发光液灵敏度低。

解决办法：选择高灵敏度化学发光液。

案例二：背景高 条带无信号

分析：

HRP酶过量。

注意：HRP酶催化ECL氧化是不可逆的，一旦底物消耗完，信号就终止了。

另外过多的HRP在某一局部位置时，催化底物反应，会产生大量自由基，自由基会使HRP失活，且会破坏抗体，膜上靶蛋白，阻碍剥离后再次孵育抗体。

解决办法：降低上样量，降低一抗二抗浓度，选择合适的化学发光液。

案例三：反白 空心带

分析：

这种情况也是由于HRP酶过量，导致局部底物快速消耗完。

解决办法：降低上样量，降低一抗和二抗的浓度。另外可以选择灵敏度低，信号持续时间久的化学发光液。

案例四：显影后膜上出现褐色印迹

分析：

HRP被氧化和失活会呈现黄褐色。HRP酶连二抗中，总有一部分HRP被氧化。但是在优化的体系中，这部分比例极小，所以不会在印迹膜上看到。当印迹膜上，局部有大量的HRP，在催化底物反应时产生大量自由基会使其失活，则会产生褐色印迹。

解决办法：降低上样量，降低一抗、二抗的浓度选择合适的化学发光液。

案例五：换了高灵敏度发光液 背景很脏

分析：

1、封闭不充分；抗体和封闭液产生交联反应；洗膜不充分；抗体浓度过高。

解决办法：增加封闭时间，优化封闭液浓度；更换其他类型封闭液；增加洗膜次数延长时间；降低抗体浓度。

2、化学发光液：灵敏度高的化学发光液可以检测出更微弱的信号，所以可能导致背景增强。

解决办法：换了灵敏度高的化学发光液，需要适当降低一抗、二抗的浓度。只有当酶和底物达到合适平衡，才能得到更好的信号，以及获得更低的背景。