产品概述

BCA蛋白定量法是目前广泛使用的蛋白定量方法之一。本产品是基于BCA(Bicin-choninic Acid)法研制而成，实现了对蛋白质进行快速、稳定、灵敏的浓度测定。其原理是在碱性环境下蛋白质分子中的肽链结构能与Cu²⁺络合生成络合物，同时将Cu²⁺还原成Cu⁺，BCA试剂可敏感特异地与Cu⁺结合，形成稳定的有颜色的复合物，其在562nm处有高的光吸收值，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可根据吸收值的大小来测定蛋白质的含量。本试剂盒含有一系列浓度的蛋白质标准品溶液(BSA溶液)，即取即用，无需稀释，方便快捷。

使用说明

• 以微孔酶标仪法为例:
• 步骤1:

  配置显色工作液：
  a. 计算显色工作液总量：
      工作液总量 = (BSA标准品样本个数＋待测样本个数)×复孔数×每个样本显色工作液体积
      举例：BSA标准品样本个数为8个，待测样本个数3个，复孔数3个。
      显色工作液总量 = (8个BSA标准品样本＋3个待测样本)×3个复孔×200μL(每个样本工作液体积) = 6.6 mL
  b. 根据计算出的所需显色工作液用量，将试剂A和试剂B按照50:1的体积比，配制显色工作液，充分混匀：
      注意：
          ⑴由于加样可能存在误差，建议配制BCA工作液时，多配制1~2个孔的量；
          ⑵新配制的BCA工作液室温密封条件下可稳定保存24h。

• 步骤2:

  定量检测：
  ① 分别取 即用型BSA标准品①~⑧ 各20μL加到 96孔板中( BSA标准品 使用前须充分溶解摇匀)
  
  ② 用1×PBS或0.9%生理盐水将样品适当稀释(可以多作几个梯度，如2倍、4倍、8倍稀释)，加20μL到96孔板的样品孔中；
  ③ 各孔加入200μL显色工作液，充分混匀，盖上96孔板盖，37℃孵育30min，冷却至室温；
      注意：也可以室温放置2h，或60℃放置30min。BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果蛋白浓度较低，可在较高温度孵育，或延长孵育时间。
  ④ 用酶标仪测定每个样品及BSA标准品的A562，或540~590nm之间的其它波长的吸光度，注意要减去空白对照(标准品①＋工作液)的吸光度。
  ⑤ 绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。
      注意：数据处理时需要去除明显错误的值。待测样品浓度可以从标准曲线中查得, 实际浓度需要乘以样品的稀释倍数。如果是计算机绘制的曲线，可以从计算机给出的线性方程式计算出待测样品的浓度。

常见问题及对策

1、提取细胞样本，可不可以通过细胞计数的方法代替蛋白定量？

Marker条带跑不出或者大条带消失原因一种是Marker本身降解，一种是电泳过程中降解。如果本身降解，电泳一开始应该就是模糊或者条带缺失的。如果是电泳过程中降解，是刚开始有，跑着跑着大条带消失。电泳过程降解，多是因为外槽电泳液加的非常满，和内槽液直接连通，导致短路，或者电极老化短路导致。

2、定量后，内参还是不齐？

首先，蛋白定量环节：注意样品中是否含有干扰物质，选择适合的定量方法；检测的值是否在线性范围内；做复孔，减小误差。

其次，转膜环节：注意转膜的均一。

最后，注意内参蛋白的选择是否合适。比如GAPDH是常用的内参蛋白，但是GAPDH是糖酵解过程中的一个酶，在缺氧，糖酵解紊乱等情况会增加GAPDH在特定细胞中的表达。内参蛋白要选表达不受实验处理影响的蛋白。

现在也有很多人用总蛋白作为内参，即通过考马斯亮蓝或者丽春红染总蛋白，伯乐的stain-free免染胶、雅酶的Omni-Easy™一步法免染胶/Super-PAGE™免染预制胶，也可以准确反应每个泳道中的蛋白量，可以作为WB的可靠内参。

3、样品间浓度差异大，如何调节浓度？

蛋白Marker每一个条带是单一纯化的蛋白，相对于目的蛋白其在膜上含量很高，所以如果抗体浓度以及抗体孵育的时间不合适，容易发生Marker蛋白和抗体非特异性结合，从而爆出条带。可以降低抗体浓度或者减少孵育时间，以及减少Marker上样量来优化。