产品概述

细胞凋亡(Apoptosis)是最常见的细胞死亡方式之一，其受到基因的严格调控。细胞凋亡过程常伴随着明显的细胞形态学变化，比如，细胞凋亡早期，质膜内侧的磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine，PS)会翻转到细胞质膜表面；而在凋亡的中后期，随着细胞质膜的通透性的增大，一些较大分子的化合物，如碘化丙啶(Propidium Iodide，PI，一种DNA结合染料)，便可自由扩散进入细胞，将细胞核染上红色荧光。
      Annexin V(膜联蛋白-V)是一种分子量为35~36kDa的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，能与磷脂酰丝氨酸高亲和力特异性结合。本试剂盒采用与绿色荧光蛋白(EGFP)融合的Annexin V作为检测磷脂酰丝氨酸的探针，配合碘化丙啶(PI)，通过使用流式细胞仪、荧光显微镜或其它荧光检测设备，可以快速检测细胞凋亡。Annexin V-EGFP凋亡检测试剂盒对细胞群进行染色后，早期凋亡细胞显示绿色荧光，晚期凋亡细胞及坏死细胞显示红色和绿色荧光，活细胞几乎没有荧光。

产品内容

操作步骤

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  对于悬浮细胞
  1. 用无菌去离子水将结合缓冲液(10×)稀释成1×结合缓冲液；
  2. 离心收集细胞(500~1,000×g，5min)；
  3. 加入预冷的PBS(pH7.4)轻轻重悬细胞，用移液器轻柔吹打洗涤，离心收集细胞，共洗涤两次；
  4. 用1×结合缓冲液重悬细胞，使细胞浓度达到1×10⁶cells/mL；
  5. 吸取100μL细胞悬液(细胞总数为1×10⁵cells)至一新EP管中，加入5μL Annexin V-EGFP和5~10μL碘化丙啶(PI)，轻轻混匀，室温避光孵育10~15min；
  6. 染色孵育后，每管加入800μL 1×结合缓冲液，轻轻混匀，离心(500×g，5min)，去上清；
  7. 向管中加入100μL或合适上样体积的1×结合缓冲液，轻轻重悬细胞，立即进行流式细胞仪检测。 如用于荧光显微镜检测，可涂片后，在荧光显微镜下进行观察。
  

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  对于贴壁细胞
  1. 用无菌去离子水将结合缓冲液(10×)稀释成1×结合缓冲液；
  2. 首先将细胞培养液吸出至一新离心管内，接着用预冷的PBS(pH7.4)轻柔地洗涤贴壁细胞一次，加入适量胰酶细胞消化液(不含EDTA)，室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞脱落下来即可，吸除胰酶细胞消化液。需避免胰酶的过度消化，以免造成假阳性；
  3. 在细胞中加入上一步骤收集的细胞培养液，稍混匀，转移至离心管内，离心(500~1,000×g，5min)，弃上清，收集细胞：
      注意:加入步骤1中的细胞培养液一方面可以收集已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞，另一方面细胞培养液中的血清可以有效抑制或中和残留的胰酶；残留的胰酶会消化并降解后续加入的Annexin V-FITC导致染色失败。
  4. 加入预冷的PBS(pH7.4)轻轻重悬细胞，用移液器轻柔吹打洗涤，离心收集细胞，共洗涤两次；
  5. 用1×结合缓冲液重悬细胞，使细胞浓度达到1×10⁶cells/mL；
  6. 吸取100μL细胞悬液(细胞总数为1×10⁵cells)至一新EP管中，加入5μL Annexin V-FITC和5~10μL碘化丙啶(PI)，轻轻混匀，室温避光孵育10~15min；
  7. 染色孵育后，每管加入800μL 1×结合缓冲液，轻轻混匀，离心(500×g，5min)，去上清；
  8. 向管中加入100μL或合适上样体积的1×结合缓冲液，轻轻重悬细胞，立即进行流式细胞仪检测。 如用于荧光显微镜检测，可涂片后，在荧光显微镜下进行观察。