大鼠β神经生长因子酶联免疫吸附测定试剂盒

Rat β-NGF ELISA Kit

英文别名:
       NGF, Beta-HSAN5, NGFB, nerve growth factor.

产品概述

      本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样品中大鼠β-NGF的浓度。大鼠β-NGF捕获抗体已经预包被于酶标板上，当加入样品或标准品时，其中的大鼠β-NGF会与捕获抗体结合，而其它游离成分则会通过洗涤被除去。接着，再加入生物素标记的大鼠β-NGF抗体后，抗大鼠β-NGF抗体与大鼠β-NGF接合，形成夹心的免疫复合物，其它游离成分则通过洗涤被除去。随后加入酶复合物，生物素与酶复合物特异性结合，这样酶复合物上的HRP就与夹心的免疫复合物连接起来，而其它游离成分则通过洗涤被除去。最后加入显色剂，若样品中存在大鼠β-NGF，则会形成免疫复合物，其上连接的HRP会催化无色的显色剂氧化生成蓝色物质，而后加入终止液，最终产物呈黄色。通过酶标仪检测，读取450nm处的OD值，大鼠β-NGF浓度与OD450值之间呈正比，通过检测标准品绘制标准曲线，对照未知样品中OD值，即可计算出样品中大鼠β-NGF的浓度。

产品内容

操作步骤

• 样品制备

  1. 根据样品种类选择相应的处理方法：

      A. 细胞上清：将细胞培养上清液100~500×g离心5min，去除悬浮物后即可；
      B. 血清样品：将全血在室温下静置0.5~2h，待其自然凝固并析出血清后，离心取黄色上清即可(4℃，1,000~2,000×g，10min)，注意请勿吸取沉淀，制备好的血清需置于冰上待用，请勿在其中添加任何防腐剂或抗凝剂;
      C. 血浆样品：使用EDTA对全血进行抗凝处理后，混合均匀置于冰上，离心取黄色上清即可(4℃，1,000~2,000×g，10min)，注意请勿吸取沉淀，制备好的血浆需置于冰上待用;
      D. 组织均浆/体液：离心去除沉淀即可。
      注意：①若待测样品无法及时检测，样品制备完成后，请分装冻存于-20℃，避免反复冻融；
      注意：②请保证待测样品清澈透明，检测前如发现样品中有悬浮物，需通过离心去除；
      注意：③为了保证检测结果准确，请勿使用溶血、黄疸、高血脂或污染的样品。

  2. 稀释样品

      查阅相关文献，预估样品中待测因子的含量，从而确定适当的稀释倍数，使稀释后样品中待测因子的浓度处于ELISA试剂盒的最佳检测范围。根据待测因子含量的不同，分别采取不同的稀释方案：
      ① 待测因子含量在10~100ng/mL范围内，一般按1:100稀释，即向297μL样品稀释液中加入3μL样品；
      ② 待测因子含量在1~10ng/mL范围内，一般按1:10稀释，即向225μL样品稀释液中加入25μL样品；
      ③ 待测因子含量在15.62~1,000pg/mL范围内，一般按1:2稀释，即向100μL样品稀释液中加入100μL样品；
      ④ 待测因子含量≤15.62pg/mL，样品一般无需稀释。
      以上方案仅供参考，实验中请详细记录样品的稀释方法。

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• 检测准备工作

  3. 试剂盒自4℃冰箱取出后，请置于室温平衡20min；如从﹣20℃取出，各组分需彻底融化后再平衡20min；检测完成后，剩余试剂请及时置于4℃或-20℃保存；

  4. 将浓缩洗涤液(25×)用双蒸水或去离子水稀释成1×洗涤液；

  5. 重组大鼠β-NGF标准品的稀释和使用(在使用前2h内准备，室温操作，请严格控制在25~28℃)
      ①配制10ng/mL标准品：取1mL样品稀释液加入标准品管内，盖好后静置15min以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解；
      ②配制1,000pg/mL标准品：取100μL 10ng/mL的标准品加入有900μL样品稀释液的EP管中，混匀，做上标记；
      ③按下表将1,000pg/mL标准品用样品稀释液进行倍比梯度稀释。(最高浓度为1,000pg/mL，将标准品稀释液作为浓度0pg/mL。)

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  管号	稀释液用量(μL)	复溶后标准品用量(μL)	标准品的最终浓度(pg/mL)
  A	0	1,000	1,000
  B	300	300(从A管中取)	500
  C	300	300(从B管中取)	250
  D	300	300(从C管中取)	125
  E	300	300(从D管中取)	62.5
  F	300	300(从E管中取)	31.25
  G	300	300(从F管中取)	15.62
  H	300	0	0

  注意：标准品复溶加样后，剩余部分请丢弃。
  
  

  6. 准备生物素标记大鼠β-NGF抗体工作液
      ①按每孔需添加100μL抗体工作液，计算其总用量(为弥补操作中的损耗，需多配制100~200μL)；
      ②按1μL生物素标记大鼠β-NGF抗体添加99μL抗体稀释液的比例配制工作液，轻轻混匀。

  7. 准备酶复合物工作液(需在使用前1h内准备)
      ①按每孔需添加100μL酶复合物工作液，计算其总用量(为弥补操作中的损耗，需多配制100~200μL）；
      ②按1μL酶复合物添加99μL酶复合物稀释液的比例配制工作液，轻轻混匀。

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• 检测流程

  8. 通过计算确定一次实验所需的板条数，取出所需板条放置于框架内，多余的板条请放回铝箔袋密封，保存于4℃或-20℃；
      注意：① 标准品和样品建议做双复孔检测；
      注意：② 每次实验均需绘制标准曲线。

  9. 将用样品稀释液稀释后的样品和不同浓度标准品(100μL/孔)分别加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育90min；
      注意：① 请查阅相关文献确定样品中待检测蛋白的大致浓度，若其大于本试剂盒标准曲线的最大标准品浓度，请将样品适当稀释后再进行检测；
      注意：② 整个加样过程不宜超过10min，否则可能会影响检测结果。

  10. 甩去酶标板内液体，无需洗板，将板倒扣在吸水纸上拍干；

  11. 加入稀释后的生物素标记大鼠β-NGF抗体工作液(100μL/孔)，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵育60min；

  12. 洗板5次，每孔1×洗涤液用量为300μL，注入与吸出间隔15~30s，洗完后将板倒扣在吸水纸上拍干；
      注意：洗涤过程至关重要，洗涤不充分会导致结果产生较大误差。

  13. 加入稀释后的酶复合物(100μL/孔)，用封板胶纸封住反应孔，37℃避光孵育30min；

  14. 洗板5次，方法同步骤12；

  15. 加入显色剂TMB(100μL/孔)，用封板胶纸封住反应孔，避光37℃反应10~25min；
      注意：① 在保存和使用时，请勿将TMB接触氧化剂和金属；
      注意：② 因实验室条件差异，最佳显色时间会有所不同。反应充分时肉眼可见标准品的前3~4孔有明显的梯度蓝色。

  16. 加入终止液(100μL/孔)，混匀后即刻使用酶标仪测量OD450，同时设定540nm或570nm作为校正波长，即可计算得到校正吸光度值 (OD450-OD540或OD450-OD570)；
      注意：读取OD值建议在10min内完成。

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• 数据分析

  17. 绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，利用计算机软件作四参数逻辑(4-PL)曲线拟合创建标准曲线，通过样品的OD值即可在标准曲线上计算出其相应浓度。
      注意：① 复孔OD值在20%的差异范围内结果才有效，复孔OD值取平均后可作为测量值；
      注意：② 若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

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• 标准曲线范例