本产品通过在DNA合成过程中掺入胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidine)类似物EdU(5-ethynyl-2’-deoxyuridine)，并在随后的点击反应(Click reaction)中将EdU标记上荧光染料Alexa Fluor 555，从而实现对细胞增殖进行简单、快速、高灵敏的检测，其检测对象包括培养的细胞或组织样品，也可检测组织切片。经试剂盒处理后的增殖细胞在荧光显微镜下发出非常明亮的红色荧光，可用于荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪及荧光酶标仪等的检测，也可进行高内涵筛选(High-Content Screening，HCS)。需注意的是，流式细胞仪或荧光酶标仪检测仅适用于细胞样品，不可用于组织切片。
本试剂盒包含EdU法检测所需的所有试剂组分，除检测细胞增殖外，还可用于细胞周期分析，为此，试剂盒中提供了蓝色细胞核染料Hoechst 33342。
反应简单
基于简单高效的点击反应，无需DNA变性灵敏度高
只需少量的小分子叠氮化物探针即可高效地标记出掺入的EdU，并且可以检测到单个细胞的增殖情况操作便捷
只需常用的多聚甲醛固定和Triton X-100穿透，就可以使叠氮化物探针有效进入细胞并发生点击反应兼容性好
不影响细胞形态，也不会干扰后续的免疫荧光和免疫组化检测，以及DNA的荧光染色
细胞的EdU标记
如下步骤以6孔板检测体系为例，如使用其它型号培养板，检测体系可以按相应比例调整。
1. 在6孔板中(如有必要可以放入盖玻片)培养适量细胞。待细胞培养过夜且恢复到正常状态后，进行所需的药物处理或者其它刺激处理等；
2. 配制2×EdU工作液：推荐EdU终浓度为10μM(1×)，用细胞培养液1:500稀释EdU(10mM)即可得到2×EdU工作液(20μM)；
注：①对于A549、HeLa和NIH/3T3等贴壁细胞，推荐EdU的使用终浓度为10μM(1×)。但细胞类型、培养液种类、细胞密度以及细胞增殖速度等多方面因素都会影响EdU掺入到细胞中的效率，故初次使用时建议进行预实验以确定EdU的最佳使用浓度；
②由于EdU工作液需与培养液等体积加入培养板中，故需要配制成2×工作液。
3. 将37℃预热的2×EdU工作液(20μM)，按与培养液相同体积加入6孔板中，使6孔板中的EdU终浓度变为1×。例如设计终浓度为10μM，原先6孔板中的培养基为1mL，则只需将1mL 2×的EdU工作液(20μM)加入到孔板中即可；
注：①如果培养基体积过大，可以先吸除适量的培养液，再加入等体积的2×EdU工作液；或者可以减少工作液的体积并提高EdU的浓度，使最终培养液中的EdU浓度为10μM，例如2mL培养液中加入220μL 0.1mM EdU；
②不建议替换所有的培养液，以免对细胞的增殖造成影响。
4. 继续孵育细胞2h。该孵育时间的长短取决于细胞生长速率，通常继续孵育时间以细胞周期10%左右为宜；
注：①对于常见的哺乳动物细胞如HeLa、3T3、HEK293等，细胞周期约为18~25h，孵育时间以2h左右为宜；
②人胚胎细胞的细胞周期约为30min，推荐孵育时间为5min；
③酵母细胞的细胞周期约3h，推荐孵育时间为20min；
④对于增殖的神经细胞，细胞周期约5天，推荐的孵育时间为1天；
⑤当孵育时间小于45min时，建议提高EdU的浓度；如孵育时间大于20h，则建议适当降低EdU的浓度。
5. 细胞的EdU标记完成后，吸弃培养液，并加入1mL固定液，室温固定15min；
注：对于流式细胞仪检测，贴壁细胞胰酶消化后用培养液重悬后再固定。
6. 去除固定液，每孔加入1mL洗涤液洗涤细胞3次，每次3~5min；
7. 去除洗涤液，每孔加入1mL通透液，室温孵育10~15min；
8. 去除通透液，每孔用1mL洗涤液洗涤细胞1~2次，每次3~5min；
9. 转至步骤EdU检测；
动物体内的EdU标记
EdU可以通过注射或进食等适当方式进行动物的体内标记。如下以小鼠为例，其它动物体内的EdU标记请参考相关文献。
1. 参照每千克体重10~200mg EdU用量，使用PBS将EdU配制成合适浓度，并通过腹腔注射、特定组织或器官局部注射、加入饮用水中等方式注入小鼠体内；
注：①此步骤中EdU用量较大，需额外购买(货号：CX000)；
②具体用量跟实验动物的种类、体重和EdU注入方式有关，可以参考相关文献，建议初次使用时可对EdU的用量进行一定的摸索，或者直接按照每千克体重50mg的用量进行测试。如果之前使用过BrdU进行实验，则可以按BrdU的用量操作。
2. 4h后或根据特定实验确定的适当时间后，快速处死小鼠，取出所需的组织，按照常规步骤制作冰冻切片或石蜡切片。EdU标记的时长也可以参考相关文献自行调整；
3. 对于冰冻切片：
⑴加入适量固定液，室温固定15min；
⑵去除固定液，用适量洗涤液洗涤3次，每次3~5min；
⑶去除洗涤液，用适量通透液，室温孵育10~15min；
⑷去除通透液，用适量洗涤液洗涤1~2次，每次3~5min；
⑸抗原修复(选做)：如果同时需要进行目的蛋白的免疫荧光染色，并有必要进行抗原修复，可以使用适当的抗原修复液进行抗原修复处理；
⑹转至步骤EdU检测；
4. 对于石蜡切片：
⑴脱蜡：将石蜡切片置于二甲苯中浸泡10min；换用新鲜二甲苯再浸泡10min；更换50%的二甲苯再浸泡5min；无水乙醇中浸泡5min；更换新的无水乙醇再浸泡5min；更换95%乙醇浸泡5min；更换85%乙醇浸泡5min；更换75%乙醇浸泡5min；更换50%乙醇浸泡5min；更换30%乙醇浸泡5min；更换PBS浸泡5min；
⑵抗原修复(选做)：如果同时需要进行目的蛋白的免疫组化染色，可以使用适当的抗原修复液进行抗原修复处理。
注：如果使用蛋白酶K或胰酶进行抗原修复，必须反复洗涤干净，否则残留的酶会严重干扰后续标记反应。
⑶转至步骤EdU检测。
EdU检测
如下步骤以6孔板中细胞样品为例，对于其它孔板或切片样品，仅需要按比例调整每步溶液的用量，其余步骤相同。
注：①6孔板每孔的反应体系为500μL反应混合物，对于12、24、48、96和384孔板，每孔的反应体系则可分别调整为200μL、100μL、70μL、50μL和20μL反应混合物；
②对于较小的培养板孔，单位培养面积的液体用量已经进行过适当增加，可以有效避免液体蒸发可能带来的负面影响；
③对于切片样本，可以根据其大小，每个切片使用100~200μL反应混合物。
1. 配制Click Additive Solution：对于CX003，用1.5mL去离子水溶解一管Click Additive，混匀至全部溶解，即为Click Additive Solution；对于CX003L，加入12mL去离子水溶解试剂盒所提供的一瓶Click Additive，混匀至全部溶解，即为Click Additive Solution。配制完成后可以分装保存于-20℃。
2. 参考下表配制Click反应液。
注：①请严格按照下表中组分顺序和体积配制Click反应液，否则点击反应可能无法有效进行；
②Click反应液须在配制后15min内使用。
3. 去除上一步骤中的洗涤液；
4. 每孔加入0.5mL Click反应液，轻轻摇晃细胞培养板以确保反应混合物将样品均匀覆盖；
5. 室温避光孵育30min，也可酌情适当延长孵育时间；
6. 吸除Click反应液，用洗涤液洗涤3次，每次3~5min；
7. 如果需要对细胞核进行染色，可以参照步骤细胞核染色进行。如无其它的特殊需求，即可在荧光显微镜下观察，或使用流式细胞仪、多功能酶标仪等进行荧光检测。555Azide的最大激发波长是555nm，最大发射波长是565nm；
细胞核染色
为了检测细胞增殖比例，可以使用Hoechst 33342进行细胞核染色。此外，高内涵筛选仪器一般也需要对细胞核进行染色。
1. 1×Hoechst 33342溶液的配制：按1:1000比例用1×PBS(货号：PS110)稀释Hoechst 33342(1000×)；
2. 接EdU检测步骤6，吸除洗涤液后，每孔加1×Hoechst 33342溶液1mL，室温避光孵育10min；
3. 吸除1×Hoechst 33342溶液，用洗涤液洗涤3次，每次3~5min；
4. 进行荧光检测。Hoechst 33342为蓝色荧光，最大激发波长为346nm，最大发射波长为460nm；
流式细胞仪检测
对于经上述EdU步骤获得的细胞悬液样品进行流式检测。如果使用传统的流体动力学聚焦的流式细胞仪来测量总DNA含量，请在检测过程中使用低流速，实验中的每个样品应使用相同的收集速率和细胞浓度。EdU标记产生的荧光信号一般使用对数刻度的横坐标。555 Azide的最大激发波长是555nm，最大发射波长是565nm。
注：①建议使用未经EdU标记的细胞样品作为流式细胞仪检测的阴性对照，并选择合适的电压；
②由于流式细胞仪检测比较灵敏，可根据细胞类型和实际染色情况对555 Azide的使用量进行适当调整。
1. Click Additive配制成溶液后请注意适当分装。如溶解后有白色物质析出，请上下颠倒数次，待其全部溶解后使用。如果该溶液颜色变成棕色，则说明已失效，请弃用；
2. 本产品完全兼容多种有机染料，如Alexa Fluor系列普通染料、fluorescein(FITC)、Allophycocyanin(APC)及APCE-tandems染料；对于Qdot纳米晶体探针、Horseradish peroxidase(HRP)、R-phycoerythrin(R-PE)和R-PE-tandems染料如Alexa Fluor 680-R-PE等，需在点击反应完成后进行反应和检测；
3. 本产品会影响GFP、RFP、mCherry等荧光蛋白的荧光，对于荧光类蛋白如Green Fluorescent Protein(GFP)、TC-FlAsHTM和TC-ReAsHTM类试剂，需在点击反应前进行反应和检测。由于Phalloidin(鬼笔环肽)不兼容点击反应，推荐使用Tubulin-Tracker Red进行细胞微管的检测；
4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作；
5. 本产品仅限科研使用。
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