产品内容

操作步骤

•    ◆

  样本处理
  1. 根据样品种类选择相应的处理方法：
      A. 悬浮细胞：离心收集细胞(4℃，500×g，10min)，弃上清后称重，按每毫克细胞50μL的比例用1×PBS(货号：PS110)洗涤2次；按每毫克细胞5~10μL的比例加入裂解/漂洗缓冲液，同时加入蛋白酶抑制剂(货号：GRF101)，混匀后置于冰上孵育5~20min(期间混匀几次)；离心收集上清液(4℃，12,000~16,000×g，10min)，置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)；
      B. 贴壁细胞：移去培养基，按每1.0×10⁵个细胞150μL的比例用1×PBS(货号：PS110)洗涤两次；用细胞刮刀刮落细胞，收集至1.5mL离心管内，按每1.0×10⁵个细胞20~30μL的比例加入裂解/漂洗缓冲液，同时加入蛋白酶抑制剂(货号：GRF101)，混匀后置于冰上孵育5~20min(期间混匀几次)；离心收集上清液(4℃，12,000~16,000×g，10min)，置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)；
      C. 大肠杆菌：离心收集大肠杆菌(4℃，12,000×g，2min)，弃上清后称重，按每克菌体(湿重)10mL的比例用1×PBS(货号：PS110)洗涤2次；按每克菌体(湿重)5~10mL的比例加入裂解/漂洗缓冲液，同时加入蛋白酶抑制剂(货号：GRF101)，重悬菌体，超声裂解细胞，离心收集上清(4℃，12,000~16,000×g，10min)

•    ◆

  凝胶预处理
  2. 用移液器轻柔吹打Anti-DYKDDDDK免疫凝胶，使其充分混悬，取25μL混合液置于新的离心管中；
  3. 向离心管中加入200~500μL裂解/漂洗缓冲液，盖上管盖，颠倒数次或轻微涡旋混匀1min，接着1,000rpm 离心5min，吸弃上清；
  4. 重复步骤3两次；

•    ◆

  蛋白与凝胶的结合
  5. 在预处理后的凝胶中加入500μL处理后的样本，置于翻转混合仪上孵育(常温2h或4℃过夜)；
  6. 将上述混合液1,000rpm离心5min，然后把上清液转移到新的离心管中备用(上清液可用于检测DYKDDDDK标签蛋白是否存在残留)，原离心管中剩余的即为蛋白-凝胶复合物；

•    ◆

  漂洗
  7. 向步骤6所得的蛋白-凝胶复合物中加入500μL裂解/漂洗缓冲液，用移液器轻柔吹打，重新分散凝胶，然后上下翻转使其彻底重悬。5000rpm离心30s，吸弃上清；
  8. 重复步骤7两次；

•    ◆

  洗脱
  9. 本操作说明书提供以下两种抗原洗脱方案，操作者可根据后期检测的需要选择不同的抗原洗脱方法。
      ●变性洗脱：此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE检测。向步骤8洗涤后的蛋白-凝胶复合物中加入80~100μL 1×SDS-PAGE上样缓冲液(由5×稀释为1×)混合均匀，100℃加热10min。待冷却后，1000rpm离心5min分离凝胶，收集上清，进行SDS-PAGE检测。
      ●非变性洗脱：此方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。向步骤8洗涤后的蛋白-凝胶复合物中加入100μL洗脱缓冲液，室温孵育5~10min；1000rpm离心5min分离凝胶，收集上清，每100μL洗出液中加入10μL中和缓冲液将洗脱产物pH调节至中性，用于后期功能分析。

常见问题及对策

•    ◆

  抗原为何没有免疫沉淀下来？
  答： ①样品中抗原含量过少，不足以被检测到
           建议：通过SDS-PAGE或Western Blot验证裂解液中蛋白的表达和裂解效率；如有必要，可加大样品用量；
         ②裂解/漂洗缓冲液中的成分干扰了抗原与抗体的结合
           建议：使用其它缓冲液进行免疫沉淀和漂洗(比如可选用含有0.5% CHAPS的TBS缓冲液)。

•    ◆

  为何获得的蛋白量过低？
  答： ①蛋白质被降解
           建议：加入蛋白酶抑制剂；
         ②所用的凝胶量不够
           建议：提高Anti-DYKDDDDK免疫凝胶用量；
         ③样品中的目标蛋白量不够
           建议：提高抗原样品量。

•    ◆

  为何有多条非特异条带？
  答： 有非特异性的蛋白结合在免疫凝胶上
         建议：在裂解/漂洗缓冲液中加入50~350mM NaCl，并加大洗脱力度和次数。

•    ◆

  如何解决凝胶易粘附管壁的现象？
  答： 建议使用低吸附率的耗材进行凝胶操作。