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操作步骤(以ProteinA/G磁珠为例)

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  样本处理
  1. 根据样品种类选择相应的处理方法：
      A. 血清样品：若目标蛋白丰度较高，建议用裂解/漂洗缓冲液稀释血清样品至目标蛋白终浓度为50~150μg/mL，置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)；
      B. 悬浮细胞：离心收集细胞(4℃，500×g，10min)，弃上清后称重，按每毫克细胞50μL的比例用1×PBS(货号：PS110)洗涤2次；按每毫克细胞5~10μL的比例加入裂解/漂洗缓冲液，同时加入蛋白酶抑制剂(货号：GRF101)，混匀后置于冰上孵育5~20min(期间混匀几次)；离心收集上清液(4℃，12,000~16,000×g，10min)，置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)；
      C. 贴壁细胞：移去培养基，按每1.0×10⁵个细胞150μL的比例用1×PBS(货号：PS110)洗涤两次；用细胞刮刀刮落细胞，收集至1.5mL离心管内，按每1.0×10⁵个细胞20~30μL的比例加入裂解/漂洗缓冲液，同时加入蛋白酶抑制剂(货号：GRF101)，混匀后置于冰上孵育5~20min(期间混匀几次)；离心收集上清液(4℃，12,000~16,000×g，10min)，置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)；
      D. 大肠杆菌：离心收集大肠杆菌(4℃，12,000×g，2min)，弃上清后称重，按每克菌体(湿重)10mL的比例用1×PBS(货号：PS110)洗涤2次；按每克菌体(湿重)5~10mL的比例加入裂解/漂洗缓冲液，同时加入蛋白酶抑制剂(货号：GRF101)，重悬菌体，超声裂解细胞，离心收集上清(4℃，12,000~16,000×g，10min)
      E. 组织样品：
          ⑴把组织剪切成细小的碎片；
          ⑵按照每20mg组织样本150~250μL的比例加入裂解/漂洗缓冲液；
              注意：如果样本裂解不充分，可以适当提高裂解/漂洗缓冲液的用量；若需要高浓度的蛋白样品，也可适当降低裂解/漂洗缓冲液的用量。
          ⑶用玻璃匀浆器匀浆，直至样本充分裂解；
              注意：若组织样本非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解/漂洗缓冲液 ，通过强烈涡旋振荡使其裂解充分。
          ⑷充分裂解后，10,000~14,000×g离心3~5min，小心地将上清液(蛋白样品)移入新的离心管中，即可进行后续步骤。

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  抗原与抗体结合
  2. 用移液器吸取500μL步骤1制备好的样品加入1.5mL离心管中，接着在其中加入2~10μg抗体(加入体积可根据抗体浓度计算)；
     注意：所加入样品中的总蛋白量推荐为500~1,000μg。
  3. 置于翻转混合仪上孵育(常温1h，4℃ 4~6h或过夜)，形成抗原-抗体复合物；
  

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  磁珠预处理
  4. 用移液器轻柔吹打Protein A/G磁珠，使其充分混悬，取25μL磁珠悬液置于1.5mL离心管中；
  5. 加入500μL裂解/漂洗缓冲液 ，用移液器轻柔吹打重悬磁珠，接着在磁力架上静置1min，待磁珠吸附到离心管侧壁上后，吸弃上清；
  6. 重复步骤5一次；

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  磁珠与抗原-抗体复合物结合
  7. 结合：将步骤3所得的抗原-抗体复合物加入预处理后的磁珠中，置于翻转混合仪上孵育(常温1h，4℃ 4~6h或过夜)。接着在磁力架上静置1min，待磁珠吸附到离心管侧壁上后，吸弃上清，离心管中剩余的即为抗原-抗体-磁珠复合物；
  8. 洗涤：在上一步得到的抗原-抗体-磁珠复合物中加入500μL裂解/漂洗缓冲液，用移液器轻柔吹打重悬磁珠，接着在磁力架上静置1min，待磁珠吸附到离心管侧壁上后，吸弃上清。再重复此步骤两次；
    注意：如后续做非变性洗脱，建议再向洗涤后的抗原-抗体-磁珠复合物中加入500μL超纯水，轻柔重悬磁珠，在磁力架上静置1min，待磁珠吸附到离心管侧壁上后，吸弃上清；
  9. 洗脱：本操作说明书提供以下两种抗原洗脱方案，操作者可根据后期检测的需要选择不同的抗原洗脱方法。
      ●变性洗脱：此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE检测。向步骤8洗涤后的抗原-抗体-磁珠复合物中加入80~100μL 1×SDS-PAGE上样缓冲液(由5×稀释为1×)混合均匀，100℃加热10min。待冷却后，将离心管在磁力架上静置1min，待磁珠吸附到离心管侧壁上后，收集上清，进行SDS-PAGE检测。
      ●非变性洗脱：此方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。向步骤8洗涤后的抗原-抗体-磁珠复合物中加入50~100μL洗脱缓冲液，室温孵育5~10min；将离心管在磁力架上静置1min，待磁珠吸附到离心管侧壁上后，收集上清液至新的离心管，每100μL洗出液中加入10μL中和缓冲液将洗脱产物pH调节至中性，用于后期功能分析。

常见问题及对策

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  如何避免磁珠在储存或使用过程中可能出现的聚集情况？
  答： 磁珠应保存在2~8℃，使用时应避免由于污染或干燥而导致的聚集。不过，磁珠在低pH值的缓冲液中发生聚集属于正常现象，不影响磁珠的正常使用。在裂解/漂洗缓冲液中添加终浓度为0.1%(V/V)的非离子型去垢剂(如Triton X-100、Tween-20或NP-40)可有效防止磁珠聚集。经过低pH值洗脱操作的磁珠可以用裂解/漂洗缓冲液洗涤至中性，然后用含有0.1%(V/V)Tween-20的Tris缓冲液(pH7.5)振荡重悬磁珠，并用超声波水浴处理2min，即可使磁珠恢复均匀状态，以上处理均不影响磁珠的抗体结合效率。

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  磁珠在使用过程中出现结块现象？
  答： 磁珠在极少数情况下会出现结块现象，一般较难振荡打散，从而导致分布不均匀，这主要是因为磁珠在磁场中放置太久而牢固地结合在一起。用超声波水浴处理2min即可打散磁珠，但要注意超声处理也会使磁珠在样品溶液中捕获的抗体脱落，因此磁珠在加样后洗脱前不宜使用该方法。

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  如何解决磁珠易粘附管壁的现象？
  答： 建议使用低吸附率的耗材进行磁珠操作。另外，在缓冲液中添加0.01%~0.1%(V/V)的非离子型去垢剂(如Triton X-100、Tween-20或NP-40)可以有效降低耗材对磁珠的粘附。

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  抗原为何没有免疫沉淀下来？
  答： ①样品中抗原含量过少，不足以被检测到
           建议：通过SDS-PAGE或Western Blot验证裂解液中蛋白的表达和裂解效率；如有必要，可加大样品用量；
         ②抗体无法结合抗原
           建议：改用另一种特异性抗体，尤其可以选择另一种识别不同抗原表位的抗体；
         ③裂解/漂洗缓冲液中的成分干扰了抗原与抗体的结合
           建议：使用其它缓冲液进行免疫沉淀和漂洗(比如可选用含有0.5% CHAPS的TBS缓冲液)。

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  为何获得的蛋白量过低？
  答： ①蛋白质被降解
           建议：加入蛋白酶抑制剂；
         ②所用的Protein A/G磁珠量不够
           建议：提高Protein A/G磁珠用量；
         ③样品中的目标蛋白量不够
           建议：提高抗原样品量。

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  为何有多条非特异条带？
  答： 有非特异性的蛋白结合在磁珠上
         建议：在裂解/漂洗缓冲液中加入50~350mM NaCl，并加大洗脱力度和次数。