自备试剂

操作步骤

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  样本处理
  1. 根据样品种类选择相应的处理方法：
       A.悬浮细胞：离心收集细胞(4℃，500×g，10min)，弃上清后称重，按每毫克细胞50μL的比例用1×PBS(货号：PS110)洗涤2次；按每毫克细胞5~10μL的比例加入结合/洗涤缓冲液，同时加入蛋白酶抑制剂(货号：GRF101)，混匀后置于冰上孵育10min；离心收集上清液(4℃，14,000×g，10min)，置于冰上备用(或置于-20℃长期保存);
       B.贴壁细胞：移去培养基，按每1.0×10⁵个细胞150μL的比例用1×PBS(货号：PS110)洗涤两次；用细胞刮刀刮落细胞，收集至1.5mL离心管内，按每1.0×10⁵个细胞20~30μL的比例加入结合/洗涤缓冲液，同时加入蛋白酶抑制剂(货号：GRF101)，混匀后置于冰上孵育10min；离心收集上清液(4℃，14,000×g，10 min)，置于冰上备用(或置于-20℃长期保存);
       C. 大肠杆菌：离心收集大肠杆菌(4℃，12,000×g，2min)，弃上清后称重，按每克菌体(湿重)10mL的比例用1×PBS(货号：PS110)洗涤2次；按每克菌体(湿重)5~10mL的比例加入结合/洗涤缓冲液 ，同时加入蛋白酶抑制剂(货号：GRF101)，重悬菌体，超声裂解细胞，离心收集上清(4℃，12,000×g，10min)。

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  磁珠预处理
  2. 用移液器轻柔吹打Anti-GFP免疫磁珠，使其充分混悬，取25~50μL磁珠悬液置于1.5mL离心管中；
  3. 加入500μL结合/洗涤缓冲液，用移液器轻柔吹打重悬磁珠，接着在磁力架上静置1min后, 吸弃上清；
  4. 重复步骤3一次；

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  样品的结合
  5. 在预处理后的磁珠中加入500μL步骤1制备好的样品，置于翻转混合仪上孵育(常温1h，4℃ 1~6h或过夜)；
  6. 将上述混合液置于磁力架上静置1min，然后把上清液转移到新的离心管中备用(上清液可用于检测GFP标签蛋白是否存在残留)，原离心管中剩余的即为蛋白-磁珠复合物；

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  洗涤
  7. 向步骤6所得的蛋白-磁珠复合物中加入500μL结合/洗涤缓冲液，用移液器轻柔吹打重悬，接着在磁力架上静置1min后, 吸弃上清；
  8. 重复步骤7大约三次，直至洗涤后的上清液OD280小于0.05为止；
     注意：如上清液的OD280仍大于0.05，则适当增加洗涤次数。

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  洗脱
  9. 本操作说明书提供以下两种抗原洗脱方案，操作者可根据后期检测的需要选择不同的抗原洗脱方法。
        变性洗脱：此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE检测。向步骤8洗涤后的蛋白-磁珠复合物中加入80~100μL 1×SDS-PAGE上样缓冲液(由5×稀释为1×)混合均匀，100℃加热10min。待冷却后，将离心管在磁力架上静置1min，待磁珠吸附到离心管侧壁上后，收集上清，进行SDS-PAGE检测。
        非变性洗脱：此方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。向步骤8洗涤后的蛋白-磁珠复合物中加入50~100μL洗脱缓冲液，室温孵育5~10min；将离心管在磁力架上静置1min，待磁珠吸附到离心管侧壁上后，收集上清液至新的离心管，每100μL洗出液中加入10μL中和缓冲液将洗脱产物pH调节至中性，用于后期功能分析。

常见问题及对策

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  如何避免磁珠在储存或使用过程中可能出现的聚集情况？
        答：磁珠应保存在2~8℃，使用时应避免由于污染或干燥而导致的聚集。不过，磁珠在低pH值的缓冲液中发生聚集属于正常现象，不影响磁珠的正常使用。在结合/洗涤缓冲液中添加终浓度为0.1%(V/V)的非离子型去垢剂(如Triton X-100、Tween-20或NP-40)可有效防止磁珠聚集。经过低pH值洗脱操作的磁珠可以用结合/洗涤缓冲液洗涤至中性，然后用含有0.1%(V/V)Tween-20的Tris缓冲液(pH7.5)振荡重悬磁珠，并用超声波水浴处理2min，即可使磁珠恢复均匀状态，以上处理均不影响磁珠的抗体结合效率。

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  如何解决磁珠易粘附管壁的现象？
        答：建议使用低吸附率的耗材进行磁珠操作。另外，在缓冲液中添加0.01%~0.1%(V/V)的非离子型去垢剂(如Triton X-100、Tween-20或NP-40)可以有效降低耗材对磁珠的粘附。

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  抗原为何没有免疫沉淀下来？
        答：①样品中抗原含量过少，不足以被检测到
                  建议：通过SDS-PAGE或Western Blot验证裂解液中蛋白的表达和裂解效率；如有必要，可加大样品用量；
               ②结合/洗涤缓冲液 中的成分干扰了抗原与抗体的结合
                  建议：使用其它缓冲液进行免疫沉淀和漂洗(比如可选用含有0.5%CHAPS的TBS缓冲液)。

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  为何获得的蛋白量过低？
        答：①蛋白质被降解
                  建议：加入蛋白酶抑制剂;
               ②所用的Anti-GFP免疫磁珠量不够
                  建议：提高Anti-GFP免疫磁珠用量。

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  为何有多条非特异条带？
        答：有非特异性的蛋白结合在磁珠上
               建议：在结合/洗涤缓冲液中加入50~350mM NaCl，并加大洗脱力度和次数。