产品参数

自备试剂

操作步骤

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  样本处理
  1. 根据样品种类选择相应的处理方法：
      A. 血清样品：若目标蛋白丰度较高，建议用结合缓冲液或1×PBS(货号：PS110)稀释血清样品至目标蛋白终浓度为10~100μg/mL，置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)
      B. 悬浮细胞：离心收集细胞(4℃，500×g，10min)，弃上清后称重，按每毫克细胞50μL的比例用1×PBS(货号：PS110)洗涤2次；按每毫克细胞5~10μL 的比例加入结合缓冲液 ，同时加入蛋白酶抑制剂(货号：GRF101)，混匀后置于冰上孵育10min；离心收集上清液(4℃，14000×g，10min)，置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)；
      C. 贴壁细胞：移去培养基，按每1.0×10⁵个细胞150μL的比例用1×PBS(货号：PS110)洗涤两次；用细胞刮刀刮落细胞，收集至1.5mL离心管内，按每1.0×10⁵个细胞20~30μL的比例加入结合缓冲液，同时加入蛋白酶抑制剂(货号：GRF101)，混匀后置于冰上孵育10min；离心收集上清液(4℃，14000×g，10min)，置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)；
      D. 大肠杆菌：离心收集大肠杆菌(4℃，12000×g，2min)，弃上清后称重，按每克菌体(湿重)10mL的比例用1×PBS(货号：PS110)洗涤2次；按每克菌体(湿重)5~10mL的比例加入结合缓冲液 ，同时加入蛋白酶抑制剂(货号：GRF101)，重悬菌体，超声裂解细胞，离心收集上清(4℃，12000×g，10min)；
      E. 组织样品：建议使用免疫(共)沉淀裂解液(货号：PS105)进行裂解，具体操作如下：
           ⑴把组织剪切成细小的碎片；
           ⑵按照每20mg组织样本150~250μL的比例加入裂解液；
              注意：如果样本裂解不充分，可以适当提高裂解液的用量；若需要高浓度的蛋白样品，也可适当降低裂解液的用量。
           ⑶用玻璃匀浆器匀浆，直至样本充分裂解；
              注意：若组织样本非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液，通过强烈涡旋振荡使其裂解充分。
           ⑷充分裂解后，10,000~14,000×g离心3~5min，小心地将上清液(蛋白样品)移入新的离心管中，即可进行后续步骤。

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  磁珠预处理
  2. 用移液器轻柔吹打Protein A/G磁珠 ，使其充分混悬，取25~50μL磁珠悬液置于1.5mL离心管中；
  3. 加入500μL结合缓冲液或1×PBS，用移液器轻柔吹打重悬磁珠，接着在磁力架上静置1min，待磁珠吸附到离心管侧壁上后，吸弃上清；
  4. 重复步骤3两次；
  

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  抗体与磁珠结合
  5. 稀释：用结合缓冲液或1×PBS稀释抗体样品至终浓度为5~50μg/mL，置于冰上备用；
  6. 结合：将500μL上步稀释好的抗体加入预处理后的磁珠中，置于翻转混合仪上孵育(常温2h，4℃ 4~6h或过夜)，接着在磁力架上静置1min，待磁珠吸附到离心管侧壁上后，把上清液转移到新的离心管中备用(上清液可用于检测抗体是否存在残留)，离心管中剩余的即为抗体-磁珠复合物；
     注意：结合过程中，磁珠可能会出现聚团或呈片状，属于正常现象，不会影响实验结果。
  7. 洗涤：在上一步得到的抗体-磁珠复合物中加入500μL结合缓冲液或1×PBS，用移液器轻柔吹打重悬磁珠，接着在磁力架上静置1min，待磁珠吸附到离心管侧壁上后，吸弃上清。再重复此步骤两次；

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  抗原与抗体-磁珠复合物结合
  8. 结合：向洗涤后的抗体-磁珠复合物中加入500μL步骤1制备好的样品，置于翻转混合仪上孵育(常温2h，4℃ 4~6h 或过夜)，接着在磁力架上静置1min，待磁珠吸附到离心管侧壁上后，吸弃上清，离心管中剩余的即为抗原-抗体-磁珠复合物；
  9.洗涤：在上一步得到的抗原-抗体-磁珠复合物中加入1mL洗涤缓冲液或1×PBS，用移液器轻柔吹打重悬磁珠，接着在磁力架上静置1min，待磁珠吸附到离心管侧壁上后，吸弃上清。再重复此步骤三次；
  10.洗脱：本操作说明书提供以下两种抗原洗脱方案，操作者可根据后期检测的需要选择不同的抗原洗脱方法。
      ●变性洗脱：此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE检测。向步骤9洗涤后的抗原-抗体-磁珠复合物中加入60μL 1×SDS-PAGE上样缓冲液(货号：LT101)混合均匀，100℃加热10min。待冷却后，将离心管在磁力架上静置1min，待磁珠吸附到离心管侧壁上后，收集上清，进行SDS-PAGE检测。
      ●非变性洗脱：此方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。向步骤9洗涤后的抗原-抗体-磁珠复合物中加入25~50μL洗脱缓冲液，室温孵育10min；将离心管在磁力架上静置1min，待磁珠吸附到离心管侧壁上后，收集上清液至新的离心管，并立即加入1μL中和缓冲液将洗脱产物pH调节至中性，用于后期功能分析。

常见问题及对策

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  如何避免磁珠在储存或使用过程中可能出现的聚集情况？
  答： 磁珠应保存在2~8℃，使用时应避免由于污染或干燥而导致的聚集。磁珠在低pH值的洗脱缓冲液中发生聚集属于正常现象，不影响磁珠的正常使用。在结合/洗涤缓冲液和洗脱缓冲液中添加终浓度为0.1%(V/V)的非离子型去垢剂(如Triton X-100、Tween-20或NP-40)可有效防止磁珠聚集。经过低pH值洗脱操作的磁珠可以用结合缓冲液洗涤至中性，然后用含有0.1%(V/V)Tween-20的Tris buffer(pH7.5)振荡重悬磁珠，并用超声波水浴处理2min，即可使磁珠恢复均匀状态，以上处理均不影响磁珠的抗体结合效率。

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  磁珠在使用过程中出现结块现象？
  答： 磁珠在极少数情况下会出现结块现象，一般较难振荡打散，从而导致分布不均匀，这主要是因为磁珠在磁场中放置太久而牢固地结合在一起。用超声波水浴处理2min即可打散磁珠，但要注意超声处理也会使磁珠在样品溶液中捕获的抗体脱落，因此磁珠在加样后洗脱前不宜使用该方法。

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  如何提高抗体与磁珠结合效率？
  答： 磁珠抗体间的结合效率与抗体的种属来源及所属亚型有关，请确认抗体的类型与Protein A配基的亲和效率。如抗体所属亚型与Protein A的亲和度较低，可以通过增加抗体与磁珠的孵育时间(30~120min)、提高结合缓冲液的pH值(8~9)及降低离子强度(25~10 mM NaCl)等方法提高亲和效率。

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  如何提高磁珠在免疫沉淀反应中的特异性？
  答： 可以先将抗体与样品进行孵育，形成抗体-抗原复合物，再用Protein A/G磁珠捕获复合物。这种方法可以提高抗体与抗原的结合效率，并降低磁珠与样品接触的时间，从而提高沉淀产物的特异性。对于蛋白质/核酸共沉淀或染色质免疫共沉淀也推荐使用此法。

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  如何解决磁珠易粘附管壁的现象？
  答： 建议使用低吸附率的耗材进行磁珠操作。另外，在缓冲液中添加0.01%~0.1%(V/V)的非离子型去垢剂(如Triton X-100、Tween-20或NP-40)可以有效降低耗材对磁珠的粘附。