产品概述

本产品是一款基于T7 RNA聚合酶的RNA体外转录试剂盒，其可以含有T7启动子序列的线性双链DNA为模板，以NTPs为底物，从T7启动子下游开始合成与模板DNA中一条链互补的RNA，短时间内即可获得大量的RNA分子。此外，转录时也可在底物中添加修饰后的核苷酸，制备生物素或染料标记的RNA。

本试剂盒可兼容长转录本和短转录本的合成，添加0.5μg DNA模板，即可收获100-200μg RNA，其转录合成的RNA可用于体外翻译、反义RNA和RNAi以及RNA剪接等相关研究。

操作步骤

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• 一、模版制备
  带有双链T7启动子的PCR产物、线性化质粒以及合成的DNA片段均可作为本产品的体外转录模板，模板可用TE缓冲液或RNase-free ddH₂O进行溶解(推荐浓度为0.5μg/uL)。

• PCR产物模板(每个反应推荐用量为0.3~0.5μg)
  PCR扩增模板DNA时，将T7启动子序列(TAATACGACTCACTATAGGG)预先加在非编码链上游引物的5'端，即可扩增得到带有T7启动子的PCR产物，经电泳确认其单一性后，即可作为体外转录模板。

• 线性化质粒模板(每个反应推荐用量为1μg)
  带T7启动子的线性化质粒可作为体外转录模板，需确保其双链为平末端或编码链5'端为突出结构，且质粒的线性化程度和纯度会影响转录的产量及RNA的完整性。
  注意：质粒线性化后，需经过纯化方可作为体外转录模板，以避免RNase、RNA、蛋白及盐残留对反应体系的干扰。

• 合成的DNA模板(每个反应推荐用量为0.3~0.5μg)
  合成的带有T7启动子的DNA片段也可以作为体外转录的模板。

• 二、体外转录
  进行体外转录实验操作，需佩戴一次性手套和口罩，并使用无核酸酶耗材和试剂，以避免引入RNase污染。
  1. 将除T7 RNA Polymerase Premix外的其它组分振荡混匀，短暂离心收集于管底，置于冰上备用；
  2. 按下表配制反应体系(根据DNA模板的长度确定其用量，推荐用量为0.3~1    μg)：
  

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• *体系以Modified UTP为例，若使用其它Modified NTP底物，可参照UTP Solution与Modified UTP比例配制反应体系。

• 3. 用移液器轻柔混匀各组分，并短暂离心收集于管底，37℃孵育2h；
      注意：① 建议在PCR仪中进行反应，将热盖打开，以避免蒸发对反应体系造成影响；
                ②可根据产物片段大小调整反应时长，如RNA产物小于300bp，可延长反应至4h或更长时间，16h过夜反应对产物质量无影响。
  4. (可选)在反应体系中加入1μL DNaseⅠ，37℃孵育15min，去除DNA模板；
      注意：相对于产物RNA，模板DNA的含量非常低，一般不用去除。
  5. RNA产物经电泳分析及纯化后，即可用于下游实验。
      注意：产物浓度极高，需用RNase-free ddH₂O稀释后再检测。

• 三、RNA纯化
  1. 向转录体系中加入等体积的Lithium Chloride Solution，混匀，12,000×g 离心2min，小心吸弃上清；
  2. 向离心管中加入200μL 75%乙醇，12,000×g离心2min，小心吸弃上清；
  3. 重复上一步操作；
  4. 吸弃上清后，将离心管开盖室温置于通风处5min，以确保彻底去除残留的乙醇；
  5. 加入 30~50 uL 的 RNase-free ddH₂O 溶解 RNA。
      注意：产物 RNA 纯化也可根据情况选择酚 / 氯仿纯化法或柱纯化法。

• 四、RNA定量
  可选择以下方法进行RNA定量：
  紫外吸收法:游离核苷酸会影响定量的准确性，定量前请先对RNA产物进行纯化；
  染料法:用RiboGreen染料进行RNA定量，游离核苷酸不会影响定量，可以对纯化或未纯化的RNA产物进行准确定量。

• 五、结果验证
  在标准体外转录反应体系中分别加入0.5kb、1.0kb、2.0kb以及3.0kb的DNA模板各0.5μg，37℃孵育2h，反应结束加入1μL DNase Ⅰ，37℃孵育15min。最后进行RNA产物纯化，并通过核酸凝胶电泳进行检测，结果如下。

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• 在标准体外转录反应体系中分别加入2.0kb和3.0kb的DNA模板各0.5μg，每隔20min对RNA转录产率进行统计，对于长片段DNA模板的体外转录，通常反应2h即可得到100μg以上的RNA。

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