产品概述

与传统的克降方法相比，无缝克降技术基于基因重组原理,无需繁琐的酶切、连接步骤，以及末端补平等操作，通过插入片段与线性化载体末端同源序列(15~25nt)的重组可将DNA片段克隆至任意线性载体的任意位点，是一种简洁高效的DNA定向克降技术。

本产品作为新一代重组克隆试剂盒，一次反应即可完成单个至多个DNA片段的重组，最快仅需5min即可完成单片段重组，阳性率高达95%以上，此外，经过优化的反应体系，能够在一定程度上耐受未纯化PCR产物中含有的杂质。

操作步骤

一、制备线性化载体
尽量选择无重复序列且GC含量均匀的区域作为克隆位点，通过酶切或反向PCR扩增，对环状载体进行线性化处理。
注意：当载体克隆位点上下游20bp区域内GC含量均在40%~60%之间时，重组效率将达到最高。
1.酶切制备线性化载体
推荐使用双酶切，可有效降低转化背景(假阳性克隆);若使用单酶切制备线性化载体，建议适当延长酶切时间，以减少环状载体残留。
注意：①本产品反应体系中无DNA连接酶，不会引发载体自连，即使用单酶切制备线性化载体，也无需进行末端脱磷酸处理；
           ②酶切完成后，建议将内切酶失活或将目的产物纯化后再用于后续重组反应。
2.反向PCR扩增制备线性化载体
推荐以预线性化质粒作为模板，并使用高保真聚合酶进行载体扩增，从而减少扩增突变的引入，以及消除环状质粒模板残留对克隆阳性率的影响。
注意：建议将PCR产物纯化后再用于后续重组反应。

二、制备插入片段
无缝克隆反应要求插入片段PCR引物的5'端必须包含与其相邻片段(插入片段或载体)末端同源的15~25nt(推荐18nt)序列，且引物总长度尽量不要超过40bp,Tm值一般在55~65℃,GC含量一般在40~60%。设计方案如下：
插入片段正向扩增引物：
5'-上游载体末端同源序列+酶切位点(可选)+基因特异性正向扩增序列-3'
插入片段反向扩增引物：
3'-基因特异性反向扩增序列+酶切位点(可选)+下游载体末端同源序列-5'
如下图所示

2.插入片段的PCR扩增
推荐使用高保真聚合酶对插入片段进行PCR扩增,在扩增结束后,建议先对PCR产物进行纯化,再用于无缝克隆反应。

三、无缝克隆
1. 在冰上配置以下反应体系

注意:①当插入片段长度小于200bp时，建议插入片段用量为载体用量的5倍；
         ②当插入单片段长度大于载体长度时，需将上述载体与插入片段用量互换；
         ③当按上述公式计算得到的用量超过最小或最大值时,建议直接按表中最小或最大用量操作；
         ④若使用的是未经纯化的线性化载体或插入片段，则加样体积不应超过总反应体积的20%；
         ⑤线性化载体过长、插入片段过长或片段数过多，均会导致阳性克降率下降；
         ⑥反应体系配制完成后,需用移液器轻轻吸打混匀各组分,切勿涡旋振荡,以避免产生气泡。
2.将上步配制的反应液瞬时离心后置于50℃,反应5~60min；
注意:①建议使用PCR仪等温控较精准的仪器进行反应；
         ②若插入1~2个片段,推荐反应时间为5~15min;若插入3~5个片段,推荐反应时间为15~30min,反应时间不足或过长均会导致克隆效率降低；
         ③若载体长度大于10kb或插入片段长度大于4kb,建议延长反应时间到30~60min；
3.将反应液瞬时离心后置于冰上冷却，用于后续转化操作或者储存于-20℃。
注意:储存于-20℃的重组产物，建议在1周内使用。

四、转化
1.将100μL感受态细胞置于冰上解冻；
注意：禁止直接用手化冻，这会影响感受态细胞的活性。
2.取5~10μL步骤三得到的重组产物，加入上步解冻后的感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置30min；
3.将上述混合液于42℃热激45~60sec，然后迅速置于冰上冷却5min；
4.在冷却后的反应液中加入500μL SOC或LB培养基(不添加抗生素)，37℃振荡培养(200rpm,40~60min)；
5.取100~300μL菌液均匀涂布在含有相应抗生素的平板培养基上，37℃倒置过夜培养。
注意：①不同感受态细胞的阳性克隆率会有所差别，建议使用转化效率>10?CFU/μg的感受态细胞；
           ②阳性对照平板通常会生长出大量白色单菌落，而阴性对照平板只会长出很少的菌落。

五、阳性克隆鉴定
以下两种方法任选其一即可：
菌落PCR
挑取单菌落至10μL ddH2O中混匀，95℃裂解10min,取1μL裂解液作为模板，进行菌落PCR鉴定。酶切鉴定
挑取单菌落接种至抗性培养基中过夜培养，提取质粒进行酶切鉴定。
注意：①检测阳性对照的阳性克隆时，菌落PCR引物可使用通用引物M13F(TGTAAAACGACGG-CCAGT)与M13R(CAGGAAACAGCTATGAC),酶切鉴定需使用Hind Ⅲ与EcoR I。
           ②菌落PCR时建议至少使用一条通用引物，以避免假阳性结果，必要时可进一步对阳性结果进行测序鉴定。